血清型別検査

(微生物部)

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血清凝集反応

確認培養等による生化学性状から属及び種が決定されたら、次に免疫血清に対する凝集反応により血清型を決める。ここでは、腸内細菌及び類似菌(ブドウ糖を分解する菌として、サルモネラ、赤痢菌、チフス菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌など)の血清型別検査の方法について述べる。 なお、病原菌の血清型の決め方は各種診断用免疫血清の説明に従って行う。

1.血清型の決定

血清型の決定は各種診断用免疫血清により行う。各種診断用免疫血清と被検菌を混和させたとき、免疫血清と対応する菌との抗原抗体反応により菌体の凝集塊が生じる。この反応を目視にて観察することで血清型の決定を行う。被検菌は普通寒天培地やHI寒天培地等に接種した純培養菌を用いて凝集反応を行うが、腸内細菌及び類似菌では確認培地のTSI寒天斜面培養菌を用いることもできる。

(1)O抗原*1(菌体抗原)、K抗原*2(莢膜抗原)の型別

*1:O抗原の由来 ohne Hauchbildung  *2:K抗原の由来 Kapsel

(2)H抗原*4(鞭毛抗原)の型別

*4: H抗原の由来 Hauchbildung

  • H凝集反応は鞭毛抗原による凝集反応であることから、鞭毛が十分発育している必要がある。生化学性状試験に用いたSIMあるいはLIM培地に発育した菌の2-3白金耳を(試薬を入れる前に)BHIかHIブイヨンに接種すると良い。
  • 36‐37℃のインキュベータで一夜培養した後、1%ホルマリン加生理食塩水を等量加えて静かに混和し、殺菌固定を兼ねて2時間ほど静置して供試する
    *長時間の培養は避ける (恒温槽で培養すると4-5時間で発育する)

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2.凝集反応

凝集反応には、スライド凝集反応と試験管内凝集反応とがある。通常はスライド凝集反応で血清型を決めるが、サルモネラのH抗原は試験管内凝集反応で血清型を決める。

(1)スライド凝集反応

(2)試験管内凝集反応

① 小試験管を用いる場合

② マイクロプレート(V型)を用いる場合

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3.H抗原の相の誘導法(相誘導)

(1) サルモネラの相誘導

  • サルモネラの多くは2つのH抗原をもち(複相菌)、通常はどちらか一方の抗原を持つ菌が優勢を占めている。まず、最初に凝集した相(1相目)のH血清型が決定したらその血清型の相誘導用免疫血清(デンカ生研)をHI半流動培地(寒天0.3-0.5%)に所定量加え、滅菌したクレーギー管を無菌的に培地の中に立てて固めた後、クレーギー管中の培地上部5mm程度のところ(矢印)まで菌を接種し、もう1つの相(2相目)を誘導する。
  • 2相目を持つ菌は、1相目のH血清型に該当しないH抗原を持つ菌で、1相目を持つ菌は血清により運動が抑えられ、2相目を持つ菌が18-22時間でクレーギー管の外側まで運動して発育する-誘導 有
  • 1つの相しかない菌もあり、最初の凝集に対応するH抗血清を加えた半流動培地では、他の相が無いため菌は動かない-誘導 無

    *Kauffman-White抗原構造表にH抗原の1相:2相が記載されているが、1相が始めに出るとは限らない。

(2)誘導後の被検菌の調製

  • 2相目を持つ菌が試験管全体に発育(18-22時間:長時間培養すると、元の相(1相目)の菌が発育してくるので注意する)したら、クレーギー管の外側上部から2-3白金耳釣菌し、BHIブイヨンに接種後、37℃の水浴中で5-6時間培養し十分に発育した菌に1%ホルマリン加生理食塩水を液体培養菌液と等量加えて、殺菌固定 (2時間くらい静置)したものを被検菌とし、凝集反応を行い抗原を決定する。

同定時間を短縮するため、生化学性状試験で使用したリジン脱炭酸試験培地をホルマリン処理して、マイクロプレートを用いた簡易法で1相目を決定する。次に生化学性状試験で使用したTSI寒天斜面培養菌で相誘導を行い(夕方接種)翌朝BHIブイヨンに接種し、4-5時間培養した後、ホルマリン処理し、同様に2相目を決定する。この方法だと血清型決定に1日の短縮が可能である。

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